海院科研动态（94）| 区分不同生理状态的环境微生物方法学研究取得新进展
微生物的物种多样性极高，数量极大，在全球物质循环和能量流动中发挥着重要的作用。由于自然环境中绝大部分微生物物种都难以在实验室里培养，因此，不依赖于培养的分子生物学方法成为当前环境微生物生态学研究的利器。从环境介质中提取、纯化DNA，然后通过聚合酶链式反应对核糖体小亚基RNA等基因扩增后进行二代或三代深度测序的方法称为DNA宏条纹码测序法（又称扩增子高通量测序法），在表征微生物多样性、群落结构与功能潜力研究中最为常用。在DNA提取过程中，除了代谢活跃、正在生长的微生物外，那些代谢基本停滞的休眠体及已死亡类群的DNA也同时被提取，从而也被扩增、测序与分类鉴定出来，这极可能影响我们对原位微生物群落结构与生态、地化功能的理解。虽然休眠类群暂时不发挥功能，但其存在与复苏关乎种群存活、地理扩散、从数量稀少到丰富的迅速转变、季节波动、扰动响应等众多生态过程，因此识别它们的身份及状态至关重要。然而，现有方法难以全面地解析复杂环境微生物群落组成及其生理、活性状态。
近期，我院海洋微型生物与物质循环研究团队与美国伍兹霍尔海洋生物学实验室的Alexandra Worden教授合作，提出了一种新的高通量测序与分析框架——“三重宏条纹码分析法”：对同一样品分别开展总DNA测序、RNA测序、经叠氮溴化丙锭（PMA）处理后的DNA测序，根据不同生理状态细胞所对应核酸序列的在库特征，将复杂微生物群落中几乎所有物种的活跃、休眠、死亡状态一次性地分辨开来。以潮间带沉积物中的微型真核生物为例，研究团队应用此方法解析了干湿交替条件下各生理/活性组份的组成与动态，结果显示：总DNA测序获得的很多物种都处于休眠状态（丰富度，13 ± 2%；序列丰度，20 ± 7%），死亡类群在总DNA中的占比也很高（丰富度，47 ± 5%；序列丰度，14 ± 5%）；沉积物从湿润到干燥的过程中，休眠类群的丰富度和序列比例都显著增加。该研究表明：休眠体在环境微生物生态学研究中不可忽视；从生理状态视角解析微生物多样性及群落组成有利于我们更好地理解生物地球化学循环过程、生态系统功能韧性及弹性。
图1 三重宏条纹码分析法的原理示意图
图2 应用“三重宏条纹码分析法”之前（A，B）与之后（C-H）真核微生物多样性与群落结构表征结果的比较
以上研究成果发表于环境微生物领域权威期刊《ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》，我院博士生邓惠文为该文章的第一作者，博士生何翠为第二作者，龚骏教授为该文章的通讯作者。（Deng Huiwen, He Cui, Worden Alexandra Z. & Gong Jun. Employing a triple metabarcoding approach to differentiate active, dormant and dead microeukaryotes in sediments. Environmental Microbiology. 2024, 26(3), e16615.）
本研究得到国家自然科学基金项目、中国国家留学基金委员会公派留学博士生项目、南方海洋与工程广东省实验室（珠海）创新项目的支持。
